pISSN 2671-8790 eISSN 2671-8804

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Review Article

J Korean Soc Transplant 2017; 31(4): 157-169

Published online December 31, 2017

https://doi.org/10.4285/jkstn.2017.31.4.157

© The Korean Society for Transplantation

Current Perspectives on Emerging CAR-Treg Cell Therapy: Based on Treg Cell Therapy in Clinical Trials and the Recent Approval of CAR-T Cell Therapy

Koeun Kang1, Junho Chung, M.D.1, Jaeseok Yang, M.D.2,3 and Hyori Kim, Ph.D.4

Department of Biochemistry and Molecular Biology, Seoul National University College of Medicine1, Transplantation Center2, Department of Surgery3, Seoul National University Hospital, Biomedical Research Center, Asan Institute for Life Sciences, Asan Medical Center4, Seoul, Korea

Correspondence to: Hyori Kim
Asan Institute for Life Sciences, Asan Medical Center, 88 Olympic-ro 43-gil, Songpa-gu, Seoul 05505, Korea
Tel: 82-2-3010-5825, Fax: 82-2-3010-4182 E-mail: hyorikim@amc.seoul.kr

Received: October 26, 2017; Accepted: October 30, 2017

Regulatory T cells (Treg) naturally rein in immune attacks, and they can inhibit rejection of transplanted organs and even reverse the progression of autoimmune diseases in mice. The initial safety trials of Treg against graft-versus-host disease (GVHD) provided evidence that the adoptive transfer of Treg is safe and capable of limiting disease progression. Supported by such evidence, numerous clinical trials have been actively investigating the efficacy of Treg targeting autoimmune diseases, type I diabetes, and organ transplant rejection, including kidney and liver. The limited quantity of Treg cells harvested from peripheral blood and subsequent in vitro culture have posed a great challenge to large-scale clinical application of Treg; nevertheless, the concept of CAR (chimeric antigen receptor)-Treg has emerged as a potential resolution to the problem. Recently, two CAR-T therapies, tisagenlecleucel and axicabtagene ciloleucel, were approved by the US FDA for the treatment of refractory or recurrent acute lymhoblastic leukemia. This approval could serve as a guideline for the production protocols for other genetically engineered T cells for clinical use as well. The phase I and II clinical trials of these agents has demonstrated that genetically engineered and antigen-targeting T cells are safe and efficacious in humans. In conclusion, both the promising results of Treg cell therapy from the clinical studies and the recent FDA approval of CAR-T therapies are paving the way for CAR-Treg therapy in clinical use.

Keywords: Transplantation, Rejection, Autoimmune disease, Regulatory T cells, Chimeric antigen receptor

1. Treg 세포 및 CAR-Treg 세포치료제 개발현황

1) 장기이식과 면역조절 T 세포(regulatory T cell)

지난 반세기 동안 의료 기술의 발전과 신약개발의 성과 덕분에 장기이식술은 심각한 만성 장기 부전 환자들에게 최적의 치료로 평가 받게 되었다. 우리나라에서는 인구 고령화로 인해 장기 부전 환자의 수가 지속해서 증가 추세를 보이며(1) 장기이식 및 이식 장기의 유지 치료를 위한 기술 발전의 필요성이 대두되고 있다.

지난 수십 년간 장기이식 면역거부반응 억제 약물은 주로 저분자 화합물 형태로 개발되었는데, 비특이적인 면역억제로 인해 발생하는 심각한 부작용과 합병증들이 문제로 대두되고 있고(2-5) 동종 조직에 대해 급성 면역거부반응을 완화하는 데에는 효과를 보이나 만성 거부반응은 완벽하게 억제하지 못하여(6,7) 이식편 소실에 이르는 경우도 상당수에 이른다(8-10). 신장과 간 이식을 살펴보면 이식편 10년 생존율은 수십 년 동안 눈에 띌 정도로 개선되지 못하였다(11,12). 또한, 비특이적인 면역억제는 병원미생물에 대한 면역 반응을 손상시키고 악성 종양에 대한 면역 감시 기능을 저하시킨다(9). 특히 장기이식 후 1년이 지난 시점부터는 감염 및 암 발생이 이식 관련 사망의 주요 원인으로 부각된다(13-15). 최근 들어 면역억제제의 비특이적인 반응으로 인한 부작용을 줄이기 위해 항체 의약품과 같은 특이적 면역억제제가 도입되어 사용되기 시작하였다(16). 아울러 면역 거부반응을 억제하여 이식편 생존율을 보존하기 위한 각종 첨단 유전자 및 세포 치료 기술에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다(17).

새로운 치료기술 중에서도 이식편 수혜자의 면역 체계에서 공여자 특이적인 내성을 이끌어내는 면역조절 T 세포(regulatory T cell; Treg) 치료법이 주목 받고 있다(18,19). T 세포의 한 종류인 Treg는 체내 면역 관용을 유지하는데 핵심적인 역할을 맡고 있다(20,21). 1995년에 Sakaguchi 등의 연구에서 CD4+CD25+T 세포가 자가 면역을 억제하는 능력을 가진 사실이 발견된 후(22), 자가면역질환이나 장기이식에서 CD4+CD25+T 세포 기능에 대한 집중적 연구가 진행되었다(18). 이후 CD8+(23), CD8+28-(24), CD4- CD8-TCR+(25), NK Treg(26), IL-10 생성 Tr1(27), TGF-b 생성 Th3 등 Treg 세포는 여러 종류로 분류되었고(28), 이중에서 CD4+CD25+FoxP3 (forkhead-box protein 3)+ 표현형 T 세포가 가장 통상적이고 포괄적인 의미의 Treg로 자리잡게 되었다(8,28-32).

흉선 유래 Treg (tTreg/nTreg)의 특징은 FoxP3의 발현량이 높다는 것이다(21). FoxP3 유전자가 결실되어 있거나 돌연변이가 있는 사람에서는 심각한 다발성 자가면역반응 질병인 IPEX 증후군(immune dysregulation polyendocrinopathy enteropathy X-linked syndrome)이 발생한다는 사실이 Treg에서 FoxP3의 중요성을 뒷받침하게 되었다(21). 이 밖에도 CD4의 높은 발현량, 인터류킨(interleukin, IL)-2 수용체 알파-체인(alpha chain)인 CD25의 높은 발현량, IL-7 수용체 알파-체인인 CD127의 낮은 발현량을 흉선 유래 Treg의 특징으로 간주한다(19).

흉선 유래 Treg 이외에도 흉선 밖에서 유도된 소량의 Treg인 말초 Treg (pTreg)도 존재한다(33). 말초 Treg의 특성은 흉선 유래 Treg 만큼 잘 알려지지는 않았지만, 만성 염증이 발생한 조직이나 이식 조직에서 주로 생성되고(34), 구강 및 내장에서 면역 관용의 유도를 담당한다는 결과가 보고된 바 있다(35). 말초 Treg은 두 가지 소분류로 구분할 수 있는데 높은 IL-10 분비량을 가진 Type-I 면역 조절 T 세포(Type-I regulatory T-cell; Tr1)와(36,37), 높은 형질전환 생장 인자(transforming growth factor, TGF)-β의 분비량을 가진 T helper 3 (Th3) 세포가 있다(38).

2) 장기이식 및 자가 면역 질환에서의 Treg 세포 치료 가능성

앞서 언급된 바와 같이 치료법으로서 Treg의 가능성은 1995년에 Sakaguchi 연구진에 의해서 자가면역질환에 대해 처음 밝혀졌다(22). CD25+ 표현형 개체들이 제거된 CD4+T 세포를 투여한 무흉선 누드(nude) 마우스에서 다양한 자가면역질환 증상들을 관찰할 수 있었는데, 그에 이어 추가적으로 CD4+CD25+ T 세포를 투여함으로써 자가면역질환의 발병을 막을 수 있었다(22). 다른 실험에서는 CD4+CD25- T 세포 투여와 동시에 동종 피부이식 혹은 이종(xenogeneic) 단백질 면역을 동시에 진행하였는데, CD4+CD25- T 세포를 투여한 실험군 마우스에서 대조군보다 현저하게 높아진 면역 반응을 관찰할 수 있었다. 반면에 CD4+CD25+ T 세포를 이어서 추가 투여한 실험군 마우스에서는 면역 반응이 유의하게 완화되었다(22).

이 연구결과에서 착안하여 Treg을 환자의 혈액으로부터 안전하게 추출, ex vivo에서 증식시켜 다시 투여하는 방법이 자가면역질환은 물론, 이식편대숙주병의 치료에서 면역억제제 투여로 발생하는 합병증을 완화하고 질병의 치료에도 직접적인 효과를 불러올 수 있는 치료 방법으로 제안되었다(18). 하지만 초기에는 임상에서의 적용이 부적합하다고 판단되었다. 실제 말초에 존재하는 Treg의 양은 제한적임에도 불구하고 매우 많은 양의 Treg이 주입 되어야만 면역 관용을 불러일으킬 수 있다는 동물실험 결과 때문이었다(39). 2004년에 Treg을 분리할 수 있고, 증식을 유도할 수 있는 자극성 항체들이 결합된 비드가 발명된 이후에서야 Treg의 대량 증식이 가능해졌다(40). 이후 다양한 동물실험이 진행되었고 장기이식(41), 이식편대숙주병(42), 다발성 경화증(43), 1형 당뇨병(44), 류마티스 관절염(45) 등에서 Treg의 유효성이 입증되었다. Treg이 임상에서는 이식편대숙주병에 대하여 처음으로 적용되었고 그 결과가 2009년에 Trzonkowski 연구진에 의해 발표되었다(46). 2005년에 HLA 일치 형제로부터 골수 이식을 받은 44세의 백인 여성에게 이식 4개월 만에 만성 이식편대숙주병이 발병하였다. 스테로이드 투여 감량을 시도할 때마다 심각한 폐쇄성 세기관지염을 겪어 결국2년 동안 다량의 면역억제제 투여에 의존하였다. 2008년에 골수 공여자로부터 추출된 CD4+CD25+CD127- 표현형 Treg을 투여 받았고, 이후 기관지확장제 투여를 중단했음에도 불구하고 환자의 폐 기능이 호전되었으며 투여하던 세 종류의 면역억제제(prednisone, tacrolimus, mycophenolate mofetil [MMF]) 중 MMF 투여의 중단과 prednisone의 대폭 감량이 가능해졌다. 2011년에는 Brunstein 연구진이 악성 혈액 종양으로 이중 제대혈 이식(double umbilical cord blood transplantation)을 받은 환자 23명에게 Treg을 투여한 임상 결과를 발표하였다(30). 이중 제대혈 이식은 단일 제대혈 이식(single umbilical cord blood transplantation)에 비해 2등급 급성 이식편대숙주병의 발병률이 높은 것으로 나타난 결과에 기초하여 이중 제대혈 이식 수혜자에 대한 Treg 임상시험이 구성되었다. 환자와 4-6/6의 HLA 일치성을 보이는 제 3의 제대혈 샘플들로부터 CD4+CD25+ 표현형 Treg만을 분리하는 과정을 거쳐 Treg이 추출되었고 항 CD3와 CD28에 대한 다클론성 활성화(polyclonal activation)를 거쳐 투여되었다. Treg을 투여하지 않은 대조군에서 2~4등급 급성 이식편대숙주병의 발병률이 61%인 것에 반해 Treg을 투여한 환자군에서는 발병률이 43%에 그치는 유의한 차이를 보였다. 만성 및 급성 이식편대숙주병에서 Treg세포 투여가 보조 치료 요법으로서 효과를 보인다는 사실이 확인되었다.

위와 같은 초기 임상시험 결과에 기초하여 세계 각국에서 다양한 질병에 대한 Treg 적용 임상시험이 진행되고 있다(8,18,47-51). 이중 가장 대규모로 진행되고 있는 The ONE Study (www.onestudy.org)는 신장 이식 수혜자를 대상으로 하며 유럽 연합의 지원을 받는 1상 임상시험이다(52). 참여국은 영국, 미국, 독일, 프랑스, 이탈리아 등이 있다. 이 임상시험은 새로운 세포치료제를 개발하고 시험하여 면역억제제에 대한 의존도를 낮춤으로써 신장 이식 환자들의 ‘이식 후 삶의 질 개선’을 목표로 하고 있다. ONE study가 이전 임상시험과 다른 점은 Treg 세포 이외에 수지상세포나 대식세포 등 다른 억제성 세포군도 시험 범주 안에 넣었다는 것이다. ONE study의 목표는 통일된 프로토콜을 사용하여 만들어진 모든 세포치료제 후보의 유효성을 정확히 비교하고 안전성을 테스트하여 어떤 세포치료제가 가장 포괄적인 임상 적용이 가능할 것인지 결정하는 것이다(51). 간이식 수혜자를 대상으로 하는 ThRiL study 또한 Treg을 이용하여 면역억제제에 대한 의존도를 낮추는 1상 및 2상 임상시험으로 현재 진행 중이다. 하지만 ONE trial이나 ThRiL study에 참여 중인 연구진 대부분이 이식 수혜자의 혈액에서 Treg 혹은 억제성 세포군을 분리 추출하여 항체 비드를 이용하여 세포 증식 및 활성화를 거쳐 다시 투여하는 방법으로 임상시험을 진행하고 있다(53). 이 방법의 문제점은 이식 수혜자 혈액 내 Treg 세포는 공여자 항원 특이적이지 않을뿐더러 비특이적인 면역 억제로 인하여 일반 면역억제제 투여와 같은 부작용이 발생할 가능성이 있다(54,55). 실제로 많은 실험 결과들이 다클론성 활성화를 통하여 생산한 Treg보다 공여자 항원 특이적 활성화를 거치는 Treg이 훨씬 뛰어난 효과를 보인다는 사실을 입증하고 있다(18,39,42,55-61).

2011년에 Sagoo 연구진은 anti-CD3/anti-CD28을 이용한 다클론성 활성화를 거친 Treg을 HLA 불일치 공여자 수지상세포와 공동배양(co-incubation)하여 항원 특이적으로 활성화한 Treg의 효능을 실험하였다(55). 먼저 진행된 실험에서 연구진은 다클론성 활성화를 거친 Treg와 항원 특이적 활성화를 거친 Treg을 분석한 결과, 활성화되었을 때 공통으로 CD69와 CD71의 발현량이 높아진다는 사실을 발견하였다. 이후 anti-CD3/anti-CD28 항체가 코팅된 비드, 혹은 HLA 불일치 수지상세포와 공동 배양한 Treg군으로부터 CD69+CD71+ Treg(활성화된 Treg)를 유세포분석(flow cytometry)을 통해 분리하였다. 연구진은 CFSE dilution assay를 통해 두 Treg 실험군에서 효과기 T 세포(effector T cell) 증식 억제 효과를 비교하였다. 그 결과, 항원 특이적 Treg는 효과기 세포에 대한 억제능력이 제삼자 수지상세포로 자극했을 때보다 훨씬 뛰어났다. 한편 다클론성 Treg는 자극물의 종류에 상관없이 비슷한 억제 능력을 보였다. 또한, 마우스에 사람 피부를 이식한 후 공여자 항원 특이적 Treg을 투여한 결과, 다클론성 Treg을 투여했을 때보다 이식편 손상이 적었고 효과기 T 세포의 이식편 침투 또한 적었다. 같은 해 Veerapathran 연구진은 항원 제공 수지상세포가 자극물로 존재할 때의 효과기 세포 50% 억제율을 통하여 다클론성 Treg와 항원 특이적 Treg의 효과를 비교하였다(62). Treg대 효과기세포 비율(Treg:Teff)에서 Treg가 다클론성일 때는 1:18까지 높아졌을 때야 억제율 50%에 도달할 수 있었지만, 항원 특이적 Treg는 1:1,275의 비율로도 효과기 세포 억제율 50%를 달성할 수 있었다(62). 이로써 특정한 항원에 대해서 면역 억제가 필요한 질병에서 항원 특이적 Treg의 중요성이 입증되었고 현재는 신장(DART study)과 간(delta study) 이식 수혜자에 대해 공여자 특이적 Treg을 이용한 임상시험이 활발히 진행되고 있다(18).

3) 장기이식 및 자가 면역 질환에서의 CAR (chimeric antigen receptor)-Treg 세포 치료 가능성

이상의 실험 결과를 고려할 때 Treg 투여를 통하여 두 가지의 치료 효과를 기대할 수 있다. 첫 번째로 특정 MHC 타입 혹은 공여자 특이적인 Treg 세포를 생산할 수 있다면 장기이식 및 이식편대숙주병에서 효과적인 Treg 적용이 가능해진다. 그리고 자가면역질환을 가진 환자에서 특정 장기나 기관을 타겟하여 활성화된 염증 부위에 우선적으로 동원될 수 있는 Treg은 매우 유용할 수 있다. 이 두 가지를 가능하게 할 방법으로 CAR-Treg 세포치료제가 제안되었다.

CAR-T 세포는 타겟 세포의 특징적인 항원을 인지하는 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)를 T 세포 표면에 삽입한 세포치료제다. CAR는 scFv 항체 절편(antibody domain), 막통과 도메인(transmembrane domain), 세포 내 신호전달도메인(signaling domain)을 통하여 T 세포 활성화를 유도한다. 동물실험에서 CAR 유전자가 도입된 Treg 세포의 유효성이 자가면역질환의 치료에서 직간접적으로 입증된 바 있다. 2008년에 Elinav 연구진에 의해 진행된 동물실험은 Treg을 포함한 모든 T 세포 표면에 2,4,6- trinitrophenol (TNP) 항원에 대한 키메라 수용체를 발현하게 하는 유전 형질 도입 마우스 라인을 생산하여 이용하였다. 해당 형질 도입 마우스에서 분리 추출한 CAR-Treg을 2,4,6-trinitrobenzene sulphonic acid (TNBS)로 급성 대장염을 유도한 야생형 마우스에 투여한 결과 대장염으로 인한 마우스 사망률이 25%에 그쳤다. 이는 야생형 Treg을 투여받은 대조군 사망률인 65%와 확연한 차이를 볼 수 있는 결과였다(63). 이뿐만 아니라 연구진은 Treg 투여 전에 세포를 염색하여 in vivo 형광 이미징으로 세포 위치와 양을 추적하였다(63). 대장염 유도 마우스에 야생형 Treg을 투여하였을 시에는 하복부에서 지속성이 떨어지는 약한 형광 반응만을 확인할 수 있었던 반면, TNP 특이적 CAR-Treg을 투여하였을 때는 복부에서 일주일 가까이 강하고 지속적인 형광 반응을 확인할 수 있었다. 이로써 CAR-Treg이 염증 부위 특이적인 이동이 가능하다는 사실을 증명하였다(63).

심각한 자가면역질환 중 하나인 다발성 경화증에서도 CAR-Treg 세포의 치료 효과가 입증되었다. 다발성 경화증 환자에서는 질병이 진행됨에 따라 Treg 세포의 억제성 활동이 감소하는 것이 여러 연구결과를 통해 보고되었는데(64-66), Treg 세포 투여를 통하여 부족한 면역 억제능력을 향상할 수 있을 것이라는 가능성이 제기되었다(67). Fransson 연구진은 FoxP3 유전자와 중추신경계를 타겟하는 항 마이엘린 희소돌기아교세포 당단백질(myelin oligodendrocyte glycoprotein, MOG) 유전자가 포함된 CAR 벡터인 CARαMOG를 투여하여, Treg세포를 형질 도입한 후 치료 효과를 관찰하였다(67). CARαMOG가 형질 도입 되어있는 Treg세포와 모의 형질이 도입된 일반 CD4+T 세포를 비교하였을 때 투여 후 7일 이후부터 CARαMOG Treg세포를 투여한 실험군 마우스에서만 유의한 증상 호전이 관찰되었고 실험 25일째에는 CARαMOG Treg 세포를 투여한 실험군 마우스에서 증상이 완벽히 호전되었다(67). 또한, 약물을 이용하여 자가면역성 뇌척수염증 증상을 재 유발시켰을 때, 일반 CD4+T 세포를 투여한 실험군 마우스는 2일 만에 재발했지만, CARαMOG 형질 전환 Treg세포를 투여한 실험군 마우스는 경미하게 증상을 보인 한 마리의 쥐를 제외한 나머지 아홉 마리의 쥐에서 증상이 재발되지 않았다(67).

자가면역질환에서 CAR-Treg의 효과가 입증됨에 따라 장기이식에서도 MHC를 타겟하는 CAR를 Treg에 삽입함으로써 이식편 근처에 Treg을 집중시키고 이식편 거부반응을 억제할 수 있는지 여부에 대한 실험이 진행되었다. Boardman 연구진이 2016년 발표한 결과에서 HLA-A2 CAR를 삽입한 Treg가 다클론성 Treg보다 HLA-A2에 대한 자극이 있을 때 효과기 T 세포를 확실하게 억제할 수 있다는 사실을 확인할 수 있다(10). 또한, HLA-A2+ 표현형의 사람 피부를 마우스에 이식하였을 때 HLA-A2 CAR Treg을 투여한 마우스에서 이식편 손상이 가장 적었다. 이 연구 결과는 CAR-Treg의 임상 적용 가능성을 제시해주었다.

2. CAR-T 세포치료제 tisagenlecleucel

1989년도에 이스라엘 Eshhar 연구진에 의해 CAR-T세포치료제의 개념이 처음 소개된 이후(68) 다양한 동물 실험 및 임상시험을 통해 치료제로서의 가능성이 입증되었다(18,69). 2012년 펜실베니아 대학교와 노바티스(Novartis)사가 CD19을 타겟하는 CAR-T 세포치료제의 임상시험을 본격적으로 시작하고 추가로 다양한 제약회사가 임상시험에 참여하면서 CAR-T 세포치료제는 더욱 주목 받기 시작하였다. 2017년 7월, 미국 식품의약처(FDA) 자문위원회가 CAR-T 요법의 승인을 만장일치로 권고하였고, 2017년 8월에 노바티스사의 백혈병 치료제인 tisagenlecleucel (Kymriah, CTL019)을 3~25세 난치성(refactory) 또는 재발성(relapsed) 급성 B 림프구성 백혈병(B cell acute lymphoblastic leukemia, ALL)에 대한 치료제로 승인하였다. 임상시험에서 치료 3개월 만에 전체 관해율 83%라는 전례 없는 효과를 보인 CAR-T 세포치료제의 첫 미국 FDA 승인은 CAR-T 세포치료제의 긍정적인 전망은 물론, 이에 대한 허가 경쟁이 본격적으로 세계 시장에 진출했다는 것을 의미한다. 미국 내 경쟁에서 노바티스사에 한 발 뒤처진 카이트파마사(Kite Pharmaceuticals)가 유럽 내 허가 경쟁에서는 우위에 있다는 기사가 보도되었고 2017년 초 카이트파마가 일본 다이이찌산쿄사와 CAR-T 치료제 개발과 상업화에 대한 협력을 체결하여 아시아 시장에까지 진출을 노리고 있다.

현재 국내에도 면역 세포치료제 개발에 주력하고 있는 연구진들이 많은 만큼 세계적 기업들이 국내 시장에까지 진출하기 전에 자체적인 기술 개발로 CAR-T세포치료제를 상업화할 가능성도 있다. 첫 CAR-T 세포치료제로 허가를 받은 노바티스사의 tisagenlecleucel에 대한 FDA 허가 및 규제 사항을 점검하고, CAR-Treg 세포치료제에 대한 식품의약품안전처 승인에 있어 FDA 지침 적용을 대비하는 것은 의미 있는 일이다.

1) CAR-T 세포치료제 제조 공정

Tisagenlecleucel은 환자 본인의 세포를 시재료로 이용하는 자가 면역 세포치료제로, 제조 공정은 고순도 T 세포 집단을 생성하도록 고안되었다. 전반의 제품 품질 검사는 제품 출시 전에 완료되었으며, Tisagenlecleucel의 외관, 특징, 순도, 양, 역가 및 안전성에 관련하여 제조된 batch 간의 일관성 또한 검증되었다.

Tisagenlecleucel 제조 공정의 주요 단계는 다음과 같이 요약할 수 있다. 우선 환자들의 혈액으로부터 혈액 단핵 세포를 채집하기 위해 환자들에게 백혈구분리반출술(leukapheresis)을 시행한다. 채집된 세포들은 냉동 보관되어 전용 택배 서비스를 통해 제조 시설로 운송되고, 이후 –120°C 이하에서 보관한다. 이때 각 백혈구분리반출 샘플은 한 번에 하나의 제품에 대해서만 작업하는 전용 팀에 할당한다. 해동 후, CAR 삽입 및 성장에 유해한 단핵 세포 및 B 계열 림프 아세포 등의 세포를 제거하는 T 세포의 개체 분리(enrichment) 절차를 시행한다. 이후 anti-CD3/anti-CD28 항체가 코팅된 비드로 T 세포를 ex vivo에서 활성화시키고 항 CD19 CAR transgene을 가지고 있는 최소 사이즈의 자체 불활성 렌티바이러스 벡터로 형질 도입을 시행한다. 형질 도입을 거친 T 세포를 이후 ex vivo에서 증식시킨 후, 세척 및 제제화 후 동결 보존한다. 제품 출하를 위한 전체 품질 검사를 냉동 보관된 최종 제품의 출하 전에 완료하고, 세포를 임상 현장으로 운송하여 환자에게 투여한다. 이러한 tisagenlecleucel 제조과정 동안 환자는 백혈병 진행 억제를 위해 연결성 화학적 항암치료(bridging chemotherapy)를 받고, 이어서 tisagenlecleucel 주입 직전, 환자 체내 현존하는 림프구 감소를 위한 화학 요법(lymphodepleting chemotherapy)을 받게 된다.

각 환자의 백혈구분리반출 샘플 batch로부터 각 환자를 위한 하나의 tisagenlecleucel batch가 제조되는 것을 원칙으로 하고, 각 환자 batch 마다 전용 장비, 재료 및 인력이 지정된다. 단, 이러한 원칙에 따라 동시에 한 시설에서 여러 환자 batch를 제조할 수 있다. 제품과 접촉하는 소모품은 모두 폐기 가능한 일회용 소모품으로 한정하였다. 노바티스는 검증된 Good X Practice (GxP) IT 솔루션(표준 혈액은행에서 쓰이는 것과 동일)에 의해 관리되는 새로운 고유성 보존 체인(chain of identity) 시스템을 수립하고, 기존에 검증된 고유성 보존 체인 (Foundation for the Accreditation of Cellular Therapy [FACT]에 의해 인증된 실험 절차들과 International Society of Blood Transfusion [ISBT]- 128 표준에 따름) 또한 사용하였다. 4가지의 주요 식별 인자(이름, 생년월일, 기증자 식별 번호[DIN] 또는 백혈구분리반출 ID, 그리고 개인 고유 식별 인자인 batch ID)가 공정 과정에서 이용되었고, 한 번에 하나의 제품에 대해서만 작업하도록 전담팀을 구성하여 팀 간 인력 이동이 없도록 하였다.

환자의 백혈구분리반출 샘플 내 세포 구성이 실제로는 다양하게 이루어져 있기 때문에 tisagenlecleucel 제조 공정은 원하지 않는 세포인 단핵 세포 및 B 계열 세포를 제거하는 공정 단계를 포함한다. T 세포의 개체 분리 및 선택적 증식 단계를 통해 환자에서 유래한 다양한 시재료 세포 구성으로부터 고순도의 T 세포 집단을 생성해낼 수 있음이 증명되어 있다.

공정 과정의 세부사항은 아래와 같다. 환자의 백혈구분리반출 샘플의 세포 조성을 분석하고, 0일째에 T 세포 개체 분리를 수행한다. 단핵구와 B 계열 세포의 비율은 유세포분석으로 측정한다. T 세포의 활성화는 항 anti-CD3/ anti-CD28 단일 클론 항체가 결합된 면역자기비드(immunomagnetic bead; Dynabeads® CD3/CD28 Cell Therapy Systems [CTS]™)를 사용하여 수행한다. 세포-비드 혼합물은 비드에 결합된 CD3+/CD45+ T 세포를 수집하기 위해 자기 분리(magnetic separation) 과정을 거치게 된다. 비드 결합 세포들은 수집 후 렌티바이러스 벡터 형질 도입 과정을 거치게 된다. 렌티바이러스 벡터 형질 도입은 CD19-targeting CAR를 코딩하는 최소 크기의 자체 불활성 렌티바이러스 벡터를 이용하고, 형질 감염은 연속 2일에 걸쳐 2회 수행한다. 두 번째 형질 감염 후인 3일째에 세포 내로 삽입되지 못한 벡터 및 잔류 벡터 입자를 제거하기 위해 배양 중인 세포를 세척한다. 세척된 세포는 일회용 배양 시스템에 다시 배양하게 되고 배양은 세포 수가 수확에 충분한 양이 될 만큼 수일 동안 지속한다. 총 생존 세포 수가 필요한 최소 세포 수에 도달하면 자기 분리 장치를 사용하여 세포를 비드에서 분리하고, 수거 및 세척한다.

세포는 각 환자 투여량에 대한 세포 수에 기초하여 저온 제형 배지에서 제형화 한다. 각 환자 투여량에 해당하는 세포 수에 따라 세포는 개별 저온 백(bag)과 바이알(vial)에 분배한다. 최종 생산물은 예비냉각 제어된 냉동고에서 보관한다. 냉동 보존된 tisagenlecleucel 백은 최종 출시 및 출하 시까지 안전한 접근 제한 구역에서 상시 모니터링되는 액체 질소 저장 탱크의 액체 질소 증기 상에 저장된다. 이때 제품 수명은 9개월로 제한된다. 급성 백혈구성 백혈병(acute lymphoblastic leukemia, ALL) 소아 환자에서 최종 투여 용량은 환자의 체중에 따라 정해지게 되는데, 체중이 50 kg 이하인 환자의 경우, 최종 제품은 kg 당 0.2~5.0×106개의 형질 도입된 T 세포가 단회 투여량으로 처방되며, 체중이 50 kg을 초과하는 환자의 경우, 0.1~2.5×108개의 형질 도입 T 세포가 단회 투여량으로 처방된다.

각 환자 특정의 tisagenlecleucel 제품의 안전성, 순도, 특징 및 효능을 유지하기 위한 특정 프로세스가 마련되어 있다. 이 프로세스는 안전성 및 순도 테스트를 통하여 제품 내 오염 물질 및 불순물이 없음을 확인하고, CAR transgene의 존재를 보장하며, 역가 테스트를 통하여 유효한 CAR 발현 및 사이토카인 분비를 보장한다. 역가 테스트는 최종 tisagenlecleucel 제품에서 CD19 발현 세포와 상호작용하여 분비되는 인터페론-γ (IFN-γ)를 ‘형질 도입 세포 당 분비량’으로 측정하여 발현된 유전자 서열(CAR-19)의 생물학적 효과를 확인하는 것이다. 개별 환자 batch 간에 형질 도입된 세포 당 IFN-γ 분비량에는 차이가 있지만, 동일 벡터로부터 제조된 tisagenlecleucel batch들을 비교했을 때에는 일관된 평균 IFN-γ 분비량이 관찰되는 것으로 보아 서로 다른 제품 batch 간에 관찰된 변동성은 시재료로 쓰인 환자 세포 및 환자 다양성에 기인하는 것으로 추정되고 있다.

벡터 및 벡터를 이용한 형질 도입 세포의 선별, 설계, 시험 및 모니터링에 상당히 많은 연구가 진행된 바 있다. 특히 우려되었던 점들은 유전적 삽입이 2차 발암으로 이어질 가능성과 벡터 요소가 재조합하여 병원성 바이러스를 생산할 가능성 등이 있었다. 이러한 우려를 해소하기 위해 최소 크기의 자가 불활성 렌티바이러스 벡터를 선택하여 감마 레트로바이러스에 비해 향상된 안전성을 제공하는 동시에 T 세포에서 장기간 안정적으로 transgene을 발현시킬 수 있도록 하였다. 이 벡터는 재조합 RCL (replication-competent lentivirus) 생성을 방지하고 발암성(oncogenicity)의 위험을 최소화하도록 설계되었다. 렌티바이러스 벡터의 안전성을 보장하기 위해서 문제 가능성이 있는 유전자 삽입 위치에 벡터의 선호도가 없다는 점과 문제적 위치에 삽입된 벡터를 포함하는 세포들이 무분별하게 증식하지 않는다는 사실을 입증한 연구 등을 포함하여 다양한 유전자 삽입 연구가 수행된 바 있다. Tisagenlecleucel 제조에 사용되는 렌티바이러스는 Good Manufacturing Practices (GMP)를 따라 일회용 소모품을 사용하여 제조되었으며, 견고하고 특성화된 제조 공정을 따라 생산되며 품질 속성을 보장하기 위한 광범위한 검사를 거친다. Tisagenle-cleucel 렌티바이러스 벡터 원료는 확실하고 예측할 수 있게 환자 T 세포 내로 CD19-targeting CAR 형질 도입을 유도함으로써 환자 세포가 CD19+ 백혈병 세포를 표적화 및 사멸시키는 능력을 부여함이 입증된 바 있다. 벡터 및 제품 테스트 결과 현재까지 RCL 발생이 없었으며 유전 삽입성 종양 발생의 증거는 발견되지 않았다.

투여 후 3개월 시점에서 관찰하였을 때 형질 도입 효율, 혹은 transgene 양성 개체 수와 best overall response 간 상관관계는 관찰되지 않았고, 전반에 걸쳐 긍정적인 호전 양상을 보였다. Cytokine release syndrome (CRS)의 중증도는 형질 도입 효율이나 transgene 개체 수와 상관관계가 없었고 역가 시험에서 측정된 IFN-γ 분비와 CRS 등급 사이에서 또한 상관관계가 관찰되지 않았다.

2) CAR-T 세포치료제 임상시험

Tisagenlecleucel의 효능과 안전성은 150명 이상의 난치성(refactory) 또는 재발성(relapsed) 급성 B 림프구성 백혈병(B cell acute lymphoblastic leukemia, ALL) 소아 및 젊은 성인 환자를 대상으로 한 3가지 임상시험에서 평가되었다.

Study B2101J는 필라델피아 아동 병원에서 실시된 단일군, 공개, 단일 기관, 1상/2a상 임상시험으로, 난치성 또는 재발성 CD19+ B 세포 악성 종양(CD19+ 백혈병 또는 림프종) 환자에서 tisagenlecleucel의 장기간 지속성, 생체 내 증식, 항 종양 활성 및 안전성을 평가하였다. 총 등록 환자 수는 71명이었고, 이 중 55명의 환자에게 tisagenlecleucel이 투여되었다. 이 임상시험은 해당 환자 집단에서 최초의 CAR-T 임상 연구였다. 등록 기준은 1세 이상 24세 이하의 CD19+ B 세포 악성 종양 환자이며, 2년 이하의 생존이 예측되고 자가 및 동종조혈모세포이식 등의 치료가 가능하지 않은 경우였으며, 최대 3회의 tisagenlecleucel 투여와 폭넓은 투여 용량 범위가 허용되었다.

Study B2205J는 미국에서 시행된 단일군, 공개, 다기관, 2상 임상시험으로 제품에 대한 주요 임상시험으로 간주된 Study B2202와 설계 및 연구 목표가 유사하였다. Study B2202보다 일찍 시작되었으므로 좀 더 긴 시간 동안 추적 조사가 가능하였으나, 등록 환자 35명, tisagenlecleucel 투여 환자 29명으로 이루어진 비교적 작은 규모의 임상시험이었다. Study B2202와는 tisagenlecleucel 임상 및 제조 현장의 지리적 위치가 다른 점도 있었다.

Study B2202는 제품 등록에 있어 주요한 역할을 한 임상시험으로써 다국가, 다기관, 단일군, 공개, 2상 임상시험으로 진행되었으며, 난치성 또는 재발성 CD19+ B 세포 악성 CD19+ 백혈병 환자를 대상으로 tisagenlecleucel의 효과 및 안전성을 평가하였다. 대상 환자는 3세에서 21세의 환자들로 구성되었으며, 총 88명의 환자가 등록되어 68명의 환자에게 tisagenlecleucel 투여가 이루어졌다.

Tisagenlecleucel의 효능에 대해 긍정적이었던 초기 데이터는 펜실베니아 대학의 Cell and Vaccine Production Facility에서 생산된 제품으로부터 얻은 결과였으며 Study B2101J에서 모든 환자에 대한 제품과 Study B2205J에서 환자 26명에 대한 제품이 이 시설에서 제조되었다. 이후 펜실베니아 대학과 노바티스의 협력으로 뉴저지주 Morris Plains의 노바티스 공장에 tisagenlecleuce 생산 공정이 전달되었다. 제품의 외관, 특성, 순도, 양, 역가 및 안전성 등의 제품 품질을 일관되게 보장하는 제조 프로세스 및 분석 테스트가 추가로 개발되었다(Table 1)(70).이후 두 제조 시설 간 제품 상동성 검사(site-to-site product comparability exercise)가 진행되었다. 두 시설 간 제품 비교에서 각 batch는 세포 생성물 분비, CD19 발현 표적 세포에 대한 기능적 반응, 공정 내 데이터 및 세포 조성 측면에서 모두 유사하였다. Study B2202의 모든 tisagenlecleucel batch는 독일 Leipzig의 Fraunhofer-Institut für Zelltherapie und Immunologie에서 생산된 환자 batch 5개를 제외하고 모두 Novartis Morris Plains 제조 시설에서 제조되었다. 모든 tisagenlecleucel batch는 같은 출처의 렌티바이러스 벡터를 사용하여 제조하였다.

Table 1 . Quality assurance of tisagenlecleucel.

Appearance and descriptionImpurities
 ColorDetermination of residual beds by microscopy
Identity Percentage of viable CD19+ B cells
 Identity by CAR qPCRQuantity
Safety Total cell count
 Bacterial endotoxins Number of viable cells (calculated)
 Sterility Dose (calculated)
 MycoplasmaPotency
 Determination of VSV-G DNA by qPCR Determination of CAR expression by flow cytometry
Purity Release of IFN-γ in response to CD19- expressing target cells
 Percentage of viable T cells
 Determination of transduction efficiency by CAR qPCR
 Cell viability

Abbreviations: CAR, chimeric antigen receptor; IFN, interferon; qPCR, quantitative polymerase chain reaction; VSV-G, vesicular stomatitis virus-G..



정량적 중합 효소 연쇄 반응(qPCR)을 사용하여 말초 혈액 및 골수에서 tisagenlecleucel transgene(개체 수/μg 게놈 DNA)의 양을 모니터링했다. 관심 대상 수치에는 tisagenlecleucel 투여 이후 변형된 T 세포의 증식 정도의 최대치를 나타내는 Cmax, 임상 반응의 최초 평가일인 28일 째 에서의 transgene 수치인 AUC0-28d와 AUC0-84d 등이 있었다. 또한, 유세포 분석(flow cytometry)을 통한 평가도 이루어졌다. 마지막으로 측정 가능한 양의 transgene이 남아있는 날짜와 해당 시점에서의 transgene 양을 나타내는 ‘Tlast’와 ‘Clast’는 체내에서 transgene의 지속성에 대한 수치로 인정되었다.

세포 동역학적 데이터의 분석에서 이끌어 낸 일차적 결론은 3가지 임상시험(Study B2202, B2205J 및 B2101J)에서 모두 유사하였다. Cmax와 AUC0-28d는 Study B2202와 B2205J에서 tisagenlecleucel에 반응성이 없었던 NR (no response) 환자군보다 CR (complete remission)이나 CRi (complete remission with incomplete blood count recovery) 환자, 즉, tisagenlecleucel에 대해 반응을 보인 환자군에서 더 높게 측정되었다(각각 104%와 73.5%). CR 또는 CRi를 보인 환자에서 transgene 농도가 최대치로 올라가기까지의 시간인 Tmax의 중앙값은 ‘투여 후 10일’이었고, 이것은 NR 환자에서 관찰된 ‘투여 후 20일’과 대비되는 결과였다. Study B2202와 B2205J에서 CR 또는 CRi 환자와 NR 환자로부터 각각 투여 후 최대 380일(Tlast) (중앙값: 102일)과 최대 83.9일(중앙값: 27.8일)까지 tisagenlecleucel을 체내에서 측정할 수 있었다. Study B2101J에서 CD19-CAR transgene은 780일까지 측정 가능했다(중앙값: 196일). 이 임상시험에서 CR 또는 CRi 환자 기하 평균 반감기(geometric mean half-life; T1/2)는 20일(CV%: 319.7%)인 반면 NR 환자에서는 2일(CV%: 47.0%)이었다. 결론적으로 말초 혈액에서의 transgene 수치를 AUC0-28d, Cmax 및 Tlast의 평균 혹은 중간값으로 비교했을 때 비반응 환자보다 CR 또는 CRi를 보인 반응 환자에서 더 높았다. 다만 이 결론의 제한점은 비반응 환자의 수가 매우 적었다는 점이다.

CR 또는 CRi 환자에서 골수 내 transgene 수치는 28일째에 가장 높았고 이후 감소로 이어졌으며 최대 6개월까지 측정할 수 있었다. 이 프로파일의 양상은 골수와 말초 혈액에서 동일했다. 반응을 보이지 않은 NR 환자들은 28일 이후 더 이상 연구에 참여하지 않았기 때문에 대부분의 NR 환자들에게서 28일 이후의 골수 샘플은 수집할 수 없었다. 골수 샘플 내에서 transgene 수치는 평균적으로 28일째 말초 혈액 내 transgene 수치의 44%(3개월, 6개월에 각각 67%, 69%)를 차지했다.

기본적인 세포 유전학 및 질병 특성, 인종, 체중, 성별 및 질병 상태 등의 내재적 인자들은 세포 동역 매개변수(cellular kinetic parameters; AUC0-28d 및 Cmax)에 영향을 끼치지 못하였다. 임상시험 등록 당시 tumor burden이 높았던 환자는 AUC0-28d 및 Cmax가 더 높았고, 이는 투여한 tisagenlecleucel이 더 많이 증식하였음을 의미한다. 이전 치료법, 동종조혈모세포이식 여부, 항 사이토카인 항체(tocilizumab 및 corticosteriods) 투여 여부 등을 포함하는 외인성 인자는 tisagenlecleucel의 증식 및 지속에 영향을 미치지 않았다.

Study B2202에서는 환자에게 가능한 가장 높은 용량(the highest feasible dose)의 tisagenlecleucel를 투여하려고 노력하였으나, 환자의 상황에 따라서 항상 가능하지는 않았다. 투여 용량과 세포 동역 매개변수 간의 명확한 연관성은 없었고, 따라서 투여 용량과 tisagenlecleucel의 증식률에서 상관관계가 존재하지 않는다는 것으로 결론이 유도되었다. 펜실베니아 대학 및 Morris Plains 시설에서 제조된 제품들간의 세포 노출 측정 지수의 차이는 없었다. 또한, T 세포 비율, 형질 도입 효율, 세포 생존력 및 총 세포 수 등의 제조 출시 특성(manufacturing release characteristics)과 세포 동역 매개변수 사이에도 유의한 상관관계가 관찰되지 않았다.

노바티스 사는 제품 출시를 위하여 Study B2202의 임상시험 설계를 비롯한 프로그램 설계에 대해 미국 FDA의 컨설팅을 받은 바 있다. FDA는 Study B2202의 프로토콜을 평가하는 과정에서 단일군 임상시험을 허용하였다. 이는 2004년에 출시 허가된 clofarabine에 대한 임상시험과 같이 구제 요법(salvage therapy)이나 완화적 치료(palliative treatment)가 유일한 선택인 환자를 대상으로 했기 때문이다. 임상시험에서 공식적인 용량 증가 연구(dose escalation study)는 시행되지 않았고 임상 2상 시험에서 사용된 용량은 Study B2101J와 Study A2201에서 얻은 결과에 근거하였다. 임상시험에서의 용량은 체중에 따라 결정되었고 매우 광범위한 용량이 테스트 되었는데, 이는 앞에서 언급한 바와 같이 투여 용량과 tisagenlecleucel의 체내 증식의 연관성이 없었기 때문이다. 환자는 세포 투여와 관련된 부작용(발열, 오한 및 메스꺼움)을 줄이기 위하여 아세트아미노펜(acetaminophen), 파라세타몰(paracetamol)과 다이펜하이드라민 (diphendyramine), 또는 H1 항히스타민으로 사전 투약을 받았다. 투여 이후 환자에게 감염 관리를 포함하여 면역억제 상태이거나 화학요법 중인 환자에게 제공되는 표준 보조 치료(standard supportive care)가 제공되었다.

3) CAR-T 세포치료제의 부작용 분석

Tisagenlecleucel 투여에 따른 부작용 중에서 cytokine release syndrome (CRS)이 가장 빈번히 발생하였으며, 이는 tisagenlecleucel의 작용 기작을 고려했을 때 예상된 결과였다. CRS는 약 81.4%의(3/4등급은 44.3%) 환자에서 발생하였다. 혈액학적 부작용(hematological events)은 주로 3, 4등급으로 발생하였고 림프구 감소 화학요법이나 T 세포 치료를 받은 환자에게서 흔히 발생하는 부작용과 유사하였는데(70), 열성 호중구감소증(febrile neutropenia)(36.1%), 백혈구 감소(30.9%), 중성구 감소(28.9%), 혈소판 감소(27.8%)가 주로 관찰되었다. Transaminase의 증가는 30%의 환자에게서 관찰되었는데, aspartate transaminase의 증가는 30.9% (3, 4등급은 18.6%), alanine transaminase의 증가는 29.9% (3, 4등급은 14.4%)의 환자에서 관찰되었다. 발열(41.2%), 식욕 감소(39.2%), 감마글로빈 저하(34.0%), 구토(34.0%), 두통(33.0%), 저혈압(32.0%), 구역질(32.0%) 등이 30% 이상의 환자에게서 발생한 부작용이었다. 이외에 빈맥(21.6%)은 30% 이하의 환자에게 발생하였으나 tisagenlecleucel 투여와 연관이 있었다. Study B2202와 B2205J에 참여한 123명의 환자 중에서 16명의 환자가 tisagenlecleucel 투여 이전에 사망하였는데, 8명의 환자는 질환의 악화로 사망하였고, 6명의 환자는 감염(3명은 폐렴, 2명은 진균 감염, 1명은 패혈증)으로, 2명의 환자는 림프구 감소로 화학요법 기간 중(1명은 다발성 장기 부전, 1명은 호흡 부전) 사망하였다. Tisagenlecleucel 투여 30일 이내 사망한 환자는 4명이었는데, 이중 2명의 환자는 질병의 진행으로, 1명의 환자는 파종성 혈관 내 응고(disseminated intravascular coagulation, DIC) 발생 후 cerebral hemorrhage로, 1명의 환자는 심장 내 mucormycotic mass 형성으로 인한 색전성 뇌졸중으로 사망하였다. Tisagenlecleucel 투여 30일 이후에 사망한 환자는 17명이었다. 14명은 질병의 진행으로, 3명의 환자는 감염(뇌염, 전신성 진균증, 하기도 세균 감염)으로 사망하였다. 감염 환자 중 뇌염과 전신성 진균증으로 사망한 환자는 tisagenlecleucel 투여 이전과 이후에 이미 3, 4등급의 호중구감소증에 이환되어 있었다.

T 세포 매개로 일어나는 독성은 대표적으로 B cell aplasia, CRS, macrophage activation syndrome (MAS), 감염, 혈구 감소증, 신경학적 증상, 종양 용해 증후군(tumor lysis syndrome, TLS) 등이 있다. 이러한 독성은 항 CD3 및 항 CD28 항체(72,73), 블리나투모맙(blinatumomab)과 같은 bispecific T cell engager(74,75), T-cell replete stem cell transplantation(76), 그리고 CAR-T(77)를 이용한 치료에서 흔히 나타난다. 이러한 독성은 대부분 T 세포나 대식세포의 활성화와 증식, 이로 인한 국소적 및 전신적 사이토카인 생성 및 암세포 사멸 과정에서 기인한 것이다.

CRS의 임상상은 고열, 떨림, 피로, 식욕부진, 메스꺼움, 구토, 설사, 발한, 두통, 뇌증(encephalopathy), 근육통, 관절통, 발열, 저혈압, 모세혈관 누출 증후군(capillary leak), 저산소증, 파종성 혈관 내 응고, MAS 등이 있다. CRS는 tisagenlecleucel 투여 후 8주 이내에 전체 환자의 81.4%(3, 4등급은 44.3%)에서 발생하였지만 이로 인한 환자의 사망이 보고된 바는 없었다. 평균적으로 tisagenlecleucel 투여 3일 후 발생하였고, 가장 늦게 발생한 환자는 투여 후 22일째에 발생하였으며 CRS는 평균 8일 동안 지속되었다. CRS 환자에게서 혈청 내 IL-6와 IFN-γ, 그리고 ferritin의 수치 상승을 관찰할 수 있었다. 34%의 환자에게 anti-cytokine therapy가 처방되었고 이후 증상의 개선이나 호전으로 이어졌다. 환자들에게는 통상적인 보조 치료가 제공되었고, 호전되지 않는 경우에는 토실리주맙(tocilizumab)의 투여가 이루어졌다. 토실리주맙으로도 개선이 없을 시에는 최종적으로 스테로이드 약물 투여가 고려되기도 하였다.

신경학적 장애(non-infectious encephalopathy/delirium)는 T 세포 매개 치료제를 투여한 환자들에서 흔히 발생한다. 신경학적 증상의 정확한 발생 원인은 밝혀져 있지 않으나 흔히 언어상실증, 떨림, 간질 발작, 혼동(12.4%), 선망(8.2%) 및 encephalopathy (9.3%) 등이 발생하는 것으로 확인되었다. 뇌증은 CRS와 동반되거나 CRS로부터 회복한 지 얼마 되지 않은 환자들에게 발생하지만, 자연히 없어지는 양상을 보인다. Tisagenlecleucel은 신경학적 증상을 보이는 환자와 증상이 없는 환자 모두의 뇌척수액 내에서 발견되는 것으로 보아 tisagenlecleucel이 직접적인 신경학적 장애의 원인은 아닌 것으로 추정하고 있다. 뇌부종(cerebral edema)은 보고된 바가 없다.

Tisagenlecleucel 투여 후 3, 6, 12개월, 이후 매년 환자 혈액 내 replication-competent lentivirus (RCL) 존재 여부를 qPCR을 통하여 검사하였고, 모든 환자에게서 발견되지 않았다. 렌티바이러스 벡터 삽입 구간 분석은 환자와 12명과 건강한 지원자 2명으로부터 생산한 tisagenlecleucel을 대상으로 이루어졌다. 앞서 언급된 바와 같이 삽입 시 문제가 될 만한 유전자 근처에 선호도가 없는 것으로 판명되었고, 또한 이러한 문제적 위치에 삽입된 벡터를 포함하는 세포들이 무분별하게 증식하는 양상은 발견되지 않았다. 아울러 최종 제품이 매우 높은 정도의 다클론성(polyclonality)을 확보한 것으로 판명되었다.

Treg 세포치료제는 이식편대숙주병 환자를 대상으로 한 임상시험에서 보조 치료 요법의 효과를 기대할 수 있다는 사실이 입증된 이후, 신장이식 환자와 간이식 환자를 대상으로 한 다국가 임상시험이 성공적으로 진행 중이다. 동물 시험 결과에서 다클론성 Treg 세포보다 공여자 항원 특이적 활성도를 가지는 세포가 더 뛰어난 효능을 보인다는 사실이 입증되면서 특정 MHC 타입 혹은 공여자 특이적인 Treg 세포 또는 과활성화된 염증 부위에 집중시킬 수 있는 항원 특이적 Treg 세포의 개발에 대한 필요성이 증대되고 있고 이와 같은 부분을 해소할 방법으로 제시된 CAR-Treg 연구가 초기 단계에 있다. 최근 치료제로 허가 받은 tisagenlecleucel은 CAR-Treg 세포치료제의 개발 및 생산 공정에 있어 가이드라인을 제공해 주고 있다. Tisagenlecleucel에서 얻은 임상 결과를 통하여 통상적인 T 세포 관련 치료제에서 발생하는 부작용 이외에 예측할 수 없었거나 치료 불가능한 부작용 발생이 없었다는 점을 확인할 수 있었고 이는 CAR-Treg 세포치료제 개발의 가능성을 제시하여 주고 있다. 다만 신경학적 부작용 발생이 다수의 환자에게서 일어나고 그 원인이 명확하지 않은 점은 CAR-Treg 세포치료제 개발에서 주의할 점으로 사료된다.

This research was supported by a grant (17172바의안212) from Ministry of Food and Drug Safety in 2017. This study was supported by the Bio & Medical Technology Development Program of the NRF funded by the Korean government, MSIP (NRF-2015M3A9D3051413, NRF-2017 M3A9G5057229).

  1. Cho H, Yu H, Shin E, Kim YH, Park SK, Jo MW. Risk factors for graft failure and death following geriatric renal transplantation. PLoS One 2016;11:e0153410.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  2. Berenson GS, Wattigney WA, Tracy RE, Newman WP 3rd, Srinivasan SR, Webber LS et al. Atherosclerosis of the aorta and coronary arteries and cardiovascular risk factors in persons aged 6 to 30 years and studied at necropsy (The Bogalusa Heart Study). Am J Cardiol 1992;70:851-8.
    Pubmed CrossRef
  3. Textor SC, Taler SJ, Canzanello VJ, Schwartz L, Augustine JE. Posttransplantation hypertension related to calcineurin inhibitors. Liver Transpl 2000;6:521-30.
    Pubmed CrossRef
  4. Nair S, Verma S, Thuluvath PJ. Obesity and its effect on survival in patients undergoing orthotopic liver transplantation in the United States. Hepatology 2002;35:105-9.
    Pubmed CrossRef
  5. Ojo AO, Held PJ, Port FK, Wolfe RA, Leichtman AB, Young EW et al. Chronic renal failure after transplantation of a nonrenal organ. N Engl J Med 2003;349:931-40.
    Pubmed CrossRef
  6. Pasquet L, Douet JY, Sparwasser T, Romagnoli P, van Meerwijk JP. Long-term prevention of chronic allograft rejection by regulatory T-cell immunotherapy involves host Foxp3-expressing T cells. Blood 2013;121:4303-10.
    Pubmed CrossRef
  7. Wojciechowski D, Vincenti F. Tofacitinib in kidney transplantation. Expert Opin Investig Drugs 2013;22:1193-9.
    Pubmed CrossRef
  8. Edozie FC, Nova-Lamperti EA, Povoleri GA, Scotta C, John S, Lombardi G et al. Regulatory T-cell therapy in the induction of transplant tolerance: the issue of subpopulations. Transplantation 2014;98:370-9.
    Pubmed CrossRef
  9. Tang Q, Bluestone JA. Regulatory T-cell therapy in transplantation: moving to the clinic. Cold Spring Harb Perspect Med 2013;3:a015552.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  10. Boardman DA, Philippeos C, Fruhwirth GO, Ibrahim MA, Hannen RF, Cooper D et al. Expression of a chimeric antigen receptor specific for donor HLA class I enhances the potency of human regulatory T cells in preventing human skin transplant rejection. Am J Transplant 2017;17:931-43.
    Pubmed CrossRef
  11. Meier-Kriesche HU, Schold JD, Kaplan B. Long-term renal allograft survival: have we made significant progress or is it time to rethink our analytic and therapeutic strategies?. Am J Transplant 2004;4:1289-95.
    Pubmed CrossRef
  12. Gelson W, Hoare M, Dawwas MF, Vowler S, Gibbs P, Alexander G. The pattern of late mortality in liver transplant recipients in the United Kingdom. Transplantation 2011;91:1240-4.
    Pubmed CrossRef
  13. Penn I. Cancers complicating organ transplantation. N Engl J Med 1990;323:1767-9.
    Pubmed CrossRef
  14. Euvrard S, Kanitakis J, Claudy A. Skin cancers after organ transplantation. N Engl J Med 2003;348:1681-91.
    Pubmed CrossRef
  15. Soltys KA, Mazariegos GV, Squires RH, Sindhi RK, Anand R, SPLIT Research Group. Late graft loss or death in pediatric liver transplantation: an analysis of the SPLIT database. Am J Transplant 2007;7:2165-71.
    Pubmed CrossRef
  16. Mahmud N, Klipa D, Ahsan N. Antibody immunosuppressive therapy in solid-organ transplant: part I. MAbs 2010;2:148-56.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  17. Geissler EK, Hutchinson JA. Cell therapy as a strategy to minimize maintenance immunosuppression in solid organ transplant recipients. Curr Opin Organ Transplant 2013;18:408-15.
    Pubmed CrossRef
  18. Boardman D, Maher J, Lechler R, Smyth L, Lombardi G. Antigen-specificity using chimeric antigen receptors: the future of regulatory T-cell therapy?. Biochem Soc Trans 2016;44:342-8.
    Pubmed CrossRef
  19. Safinia N, Leech J, Hernandez-Fuentes M, Lechler R, Lombardi G. Promoting transplantation tolerance;adoptive regulatory T cell therapy. Clin Exp Immunol 2013;172:158-68.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  20. Sakaguchi S, Wing K, Onishi Y, Prieto-Martin P, Yamaguchi T. Regulatory T cells: how do they suppress immune responses?. Int Immunol 2009;21:1105-11.
    Pubmed CrossRef
  21. Bennett CL, Christie J, Ramsdell F, Brunkow ME, Ferguson PJ, Whitesell L et al. The immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked syndrome (IPEX) is caused by mutations of FOXP3. Nat Genet 2001;27:20-1.
    Pubmed CrossRef
  22. Sakaguchi S, Sakaguchi N, Asano M, Itoh M, Toda M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. J Immunol 1995;155:1151-64.
    Pubmed
  23. Gilliet M, Liu YJ. Generation of human CD8 T regulatory cells by CD40 ligand-activated plasmacytoid dendritic cells. J Exp Med 2002;195:695-704.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  24. Haribhai D, Lin W, Relland LM, Truong N, Williams CB, Chatila TA. Regulatory T cells dynamically control the primary immune response to foreign antigen. J Immunol 2007;178:2961-72.
    Pubmed CrossRef
  25. Zhang ZX, Yang L, Young KJ, DuTemple B, Zhang L. Identification of a previously unknown antigen-specific regulatory T cell and its mechanism of suppression. Nat Med 2000;6:782-9.
    Pubmed CrossRef
  26. Seino KI, Fukao K, Muramoto K, Yanagisawa K, Takada Y, Kakuta S et al. Requirement for natural killer T (NKT) cells in the induction of allograft tolerance. Proc Natl Acad Sci U S A 2001;98:2577-81.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  27. Battaglia M, Gregori S, Bacchetta R, Roncarolo MG. Tr1 cells: from discovery to their clinical application. Semin Immunol 2006;18:120-7.
    Pubmed CrossRef
  28. Sagoo P, Lombardi G, Lechler RI. Regulatory T cells as therapeutic cells. Curr Opin Organ Transplant 2008;13:645-53.
    Pubmed CrossRef
  29. Bluestone JA, Buckner JH, Fitch M, Gitelman SE, Gupta S, Hellerstein MK et al. Type 1 diabetes immunotherapy using polyclonal regulatory T cells. Sci Transl Med 2015;7:315ra189.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  30. Brunstein CG, Miller JS, Cao Q, McKenna DH, Hippen KL, Curtsinger J et al. Infusion of ex vivo expanded T regulatory cells in adults transplanted with umbilical cord blood: safety profile and detection kinetics. Blood 2011;117:1061-70.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  31. Juvet SC, Whatcott AG, Bushell AR, Wood KJ. Harnessing regulatory T cells for clinical use in transplantation: the end of the beginning. Am J Transplant 2014;14:750-63.
    Pubmed CrossRef
  32. Lee K, Nguyen V, Lee KM, Kang SM, Tang Q. Attenuation of donor-reactive T cells allows effective control of allograft rejection using regulatory T cell therapy. Am J Transplant 2014;14:27-38.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  33. Curotto de Lafaille MA, Lafaille JJ. Natural and adaptive foxp3+regulatory T cells: more of the same or a division of labor?. Immunity 2009;30:626-35.
    Pubmed CrossRef
  34. Cobbold SP, Waldmann H. Regulatory cells and transplantation tolerance. Cold Spring Harb Perspect Med 2013;3:a015545.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  35. Coombes JL, Siddiqui KR, Arancibia-Carcamo CV, Hall J, Sun CM, Belkaid Y et al. A functionally specialized population of mucosal CD103+DCs induces Foxp3+regulatory T cells via a TGF-beta and retinoic acid-dependent mech-anism. J Exp Med 2007;204:1757-64.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  36. Barrat FJ, Cua DJ, Boonstra A, Richards DF, Crain C, Savelkoul HF et al. In vitro generation of interleukin 10-producing regulatory CD4(+) T cells is induced by immunosuppressive drugs and inhibited by T helper type 1 (Th1)- and Th2-inducing cytokines. J Exp Med 2002;195:603-16.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  37. Levings MK, Sangregorio R, Galbiati F, Squadrone S, de Waal Malefyt R, Roncarolo MG. IFN-alpha and IL-10 induce the differentiation of human type 1 T regulatory cells. J Immunol 2001;166:5530-9.
    Pubmed CrossRef
  38. Chen Y, Kuchroo VK, Inobe J, Hafler DA, Weiner HL. Regulatory T cell clones induced by oral tolerance: suppression of autoimmune encephalomyelitis. Science 1994;265:1237-40.
    Pubmed CrossRef
  39. Hoffmann P, Ermann J, Edinger M, Fathman CG, Strober S. Donor-type CD4(+)CD25(+) regulatory T cells suppress lethal acute graft-versus-host disease after allogeneic bone marrow transplantation. J Exp Med 2002;196:389-99.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  40. Hoffmann P, Eder R, Kunz-Schughart LA, Andreesen R, Edinger M. Large-scale in vitro expansion of polyclonal human CD4(+)CD25high regulatory T cells. Blood 2004;104:895-903.
    Pubmed CrossRef
  41. Kingsley CI, Karim M, Bushell AR, Wood KJ. CD25+CD4+regulatory T cells prevent graft rejection: CTLA-4- and IL-10-dependent immunoregulation of alloresponses. J Immunol 2002;168:1080-6.
    Pubmed CrossRef
  42. Taylor PA, Lees CJ, Blazar BR. The infusion of ex vivo activated and expanded CD4(+)CD25(+) immune regulatory cells inhibits graft-versus-host disease lethality. Blood 2002;99:3493-9.
    Pubmed CrossRef
  43. Kohm AP, Carpentier PA, Anger HA, Miller SD. Cutting edge: CD4+CD25+regulatory T cells suppress antigen-specific autoreactive immune responses and central nervous system inflammation during active experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol 2002;169:4712-6.
    Pubmed CrossRef
  44. Tang Q, Henriksen KJ, Bi M, Finger EB, Szot G, Ye J et al. In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes. J Exp Med 2004;199:1455-65.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  45. Morgan ME, Flierman R, van Duivenvoorde LM, Witteveen HJ, van Ewijk W, van Laar JM et al. Effective treatment of collagen-induced arthritis by adoptive transfer of CD25+regulatory T cells. Arthritis Rheum 2005;52:2212-21.
    Pubmed CrossRef
  46. Trzonkowski P, Bieniaszewska M, Juscinska J, Dobyszuk A, Krzystyniak A, Marek N et al. First-in-man clinical results of the treatment of patients with graft versus host disease with human ex vivo expanded CD4+CD25+CD127- T regulatory cells. Clin Immunol 2009;133:22-6.
    Pubmed CrossRef
  47. Di Ianni M, Falzetti F, Carotti A, Terenzi A, Castellino F, Bonifacio E et al. Tregs prevent GVHD and promote immune reconstitution in HLA-haploidentical transplantation. Blood 2011;117:3921-8.
    Pubmed CrossRef
  48. Edinger M, Hoffmann P. Regulatory T cells in stem cell transplantation: strategies and first clinical experiences. Curr Opin Immunol 2011;23:679-84.
    Pubmed CrossRef
  49. Theil A, Tuve S, Oelschlagel U, Maiwald A, Dohler D, Ossmann D et al. Adoptive transfer of allogeneic regulatory T cells into patients with chronic graft-versus-host disease. Cytotherapy 2015;17:473-86.
    Pubmed CrossRef
  50. Bacchetta R, Lucarelli B, Sartirana C, Gregori S, Lupo Stanghellini MT, Miqueu P et al. Immunological outcome in haploidentical-HSC transplanted patients treated with IL-10-anergized donor T cells. Front Immunol 2014;5:16.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  51. Geissler EK. The ONE Study compares cell therapy products in organ transplantation: introduction to a review series on suppressive monocyte-derived cells. Transplant Res 2012;1:11.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  52. The ONE Study. A unified approach to evaluating cellular immunotherapy in solid organ transplantation [Internet]. Regensburg: The ONE Study; c2011 [cited 2017 Nov 2].
    Available from: http://www.onestudy.org
  53. Trzonkowski P, Bacchetta R, Battaglia M, Berglund D, Bohnenkamp HR, ten Brinke A et al. Hurdles in therapy with regulatory T cells. Sci Transl Med 2015;7:304ps18.
    Pubmed CrossRef
  54. Niemann N, Sawitzki B. Treg therapy in transplantation: how and when will we do it?. Curr Transplant Rep 2015;2:233-41.
    CrossRef
  55. Sagoo P, Ali N, Garg G, Nestle FO, Lechler RI, Lombardi G. Human regulatory T cells with alloantigen specificity are more potent inhibitors of alloimmune skin graft damage than polyclonal regulatory T cells. Sci Transl Med 2011;3:83ra42.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  56. Joffre O, Santolaria T, Calise D, Al Saati T, Hudrisier D, Romagnoli P et al. Prevention of acute and chronic allograft rejection with CD4+CD25+Foxp3+regulatory T lymph-ocytes. Nat Med 2008;14:88-92.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  57. Tsang JY, Tanriver Y, Jiang S, Leung E, Ratnasothy K, Lombardi G et al. Indefinite mouse heart allograft survival in recipient treated with CD4(+)CD25(+) regulatory T cells with indirect allospecificity and short term immuno-suppression. Transpl Immunol 2009;21:203-9.
    Pubmed CrossRef
  58. Nafady-Hego H, Li Y, Ohe H, Zhao X, Satoda N, Sakaguchi S et al. The generation of donor-specific CD4+CD25++CD45RA+naive regulatory T cells in operationally tolerant patients after pediatric living-donor liver transplantation. Transplantation 2010;90:1547-55.
    Pubmed CrossRef
  59. Davies JK, Nadler LM, Guinan EC. Expansion of allospecific regulatory T cells after anergized, mismatched bone marrow transplantation. Sci Transl Med 2009;1:1ra3.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  60. Putnam AL, Safinia N, Medvec A, Laszkowska M, Wray M, Mintz MA et al. Clinical grade manufacturing of human alloantigen-reactive regulatory T cells for use in trans-plantation. Am J Transplant 2013;13:3010-20.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  61. Tsang JY, Tanriver Y, Jiang S, Xue SA, Ratnasothy K, Chen D et al. Conferring indirect allospecificity on CD4+CD25+Tregs by TCR gene transfer favors transplantation tolerance in mice. J Clin Invest 2008;118:3619-28.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  62. Veerapathran A, Pidala J, Beato F, Yu XZ, Anasetti C. Ex vivo expansion of human Tregs specific for alloantigens presented directly or indirectly. Blood 2011;118:5671-80.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  63. Elinav E, Waks T, Eshhar Z. Redirection of regulatory T cells with predetermined specificity for the treatment of experimental colitis in mice. Gastroenterology 2008;134:2014-24.
    Pubmed CrossRef
  64. Fransson M, Burman J, Lindqvist C, Atterby C, Fagius J, Loskog A. T regulatory cells lacking CD25 are increased in MS during relapse. Autoimmunity 2010;43:590-7.
    Pubmed CrossRef
  65. Venken K, Hellings N, Thewissen M, Somers V, Hensen K, Rummens JL et al. Compromised CD4+CD25(high) regulatory T-cell function in patients with relapsing-remitting multiple sclerosis is correlated with a reduced frequency of FOXP3-positive cells and reduced FOXP3 expression at the single-cell level. Immunology 2008;123:79-89.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  66. Haas J, Hug A, Viehover A, Fritzsching B, Falk CS, Filser A et al. Reduced suppressive effect of CD4+CD25high regulatory T cells on the T cell immune response against myelin oligodendrocyte glycoprotein in patients with multiple sclerosis. Eur J Immunol 2005;35:3343-52.
    Pubmed CrossRef
  67. Fransson M, Piras E, Burman J, Nilsson B, Essand M, Lu B et al. CAR/FoxP3-engineered T regulatory cells target the CNS and suppress EAE upon intranasal delivery. J Neuroinflammation 2012;9:112.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  68. Gross G, Waks T, Eshhar Z. Expression of immunoglo-bulin-T-cell receptor chimeric molecules as functional receptors with antibody-type specificity. Proc Natl Acad Sci U S A 1989;86:10024-8.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  69. Cheadle EJ, Gornall H, Baldan V, Hanson V, Hawkins RE, Gilham DE. CAR T cells: driving the road from the laboratory to the clinic. Immunol Rev 2014;257:91-106.
    Pubmed CrossRef
  70. Novartis. Oncologic Drugs Advisory Committee Briefing Document: Tisagenlecleucel (CTL019). Silver Spring: U.S. Food & Drug Administration: 2017.
  71. Brudno JN, Kochenderfer JN. Toxicities of chimeric antigen receptor T cells: recognition and management. Blood 2016;127:3321-30.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  72. Chatenoud L, Ferran C, Legendre C, Thouard I, Merite S, Reuter A et al. In vivo cell activation following OKT3 administration. Systemic cytokine release and modulation by corticosteroids. Transplantation 1990;49:697-702.
    Pubmed CrossRef
  73. Suntharalingam G, Perry MR, Ward S, Brett SJ, Castello- Cortes A, Brunner MD et al. Cytokine storm in a phase 1 trial of the anti-CD28 monoclonal antibody TGN1412. N Engl J Med 2006;355:1018-28.
    Pubmed CrossRef
  74. Grupp SA, Kalos M, Barrett D, Aplenc R, Porter DL, Rheingold SR et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. N Engl J Med 2013;368:1509-18.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  75. Topp MS, Gokbuget N, Stein AS, Zugmaier G, O'Brien S, Bargou RC et al. Safety and activity of blinatumomab for adult patients with relapsed or refractory B-precursor acute lymphoblastic leukaemia: a multicentre, single-arm, phase 2 study. Lancet Oncol 2015;16:57-66.
    Pubmed CrossRef
  76. Abboud R, Keller J, Slade M, DiPersio JF, Westervelt P, Rettig MP et al. Severe cytokine-release syndrome after T cell-replete peripheral blood haploidentical donor transplantation is associated with poor survival and anti-IL-6 therapy is safe and well tolerated. Biol Blood Marrow Transplant 2016;22:1851-60.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  77. Ruella M, June CH. Chimeric antigen receptor T cells for B cell neoplasms: choose the right CAR for you. Curr Hematol Malig Rep 2016;11:368-84.
    Pubmed CrossRef